چگونه از اولتراسوند برای تخریب سلول و استخراج DNA/RNA استفاده کنیم؟

چگونه از اولتراسوند برای تخریب سلولی و استخراج DNA/RNA استفاده کنیم؟

اولتراسوند یک فناوری کارآمد و پرکاربرد در تخریب سلولی و استخراج اسید نوکلئیک (DNA/RNA) است. اصل اساسی آن استفاده از اثر کاویتاسیون و ارتعاش مکانیکی برای از بین بردن ساختار سلولی و آزاد کردن مواد داخلی است. در ادامه توضیحی از مکانیسم خاص، فرآیند کاربرد و اقدامات احتیاطی کلیدی ارائه شده است:

I. اصل و فرآیند اولتراسوند برای تخریب سلولی
هسته اصلی تخریب سلولی، از بین بردن غشای سلولی (سلول های حیوانی) یا دیواره سلولی + غشای سلولی (گیاهان، باکتری ها، قارچ ها و غیره) برای آزاد کردن مواد درون سلولی (مانند اسیدهای نوکلئیک، پروتئین ها، اندامک ها و غیره) است. اولتراسوند این فرآیند را از طریق مکانیسم های زیر به دست می آورد:
1. اصل اساسی: اثر کاویتاسیون
اولتراسوند یک موج مکانیکی با فرکانس بالا با فرکانس بالاتر از 20 کیلوهرتز است. هنگامی که پروب اولتراسونیک (تقویت کننده تخریب کننده اولتراسونیک) در یک نمونه مایع حاوی سلول ها قرار می گیرد، ارتعاش با فرکانس بالا (معمولاً 15-50 کیلوهرتز) ایجاد می شود که باعث ایجاد کاویتاسیون در محیط مایع می شود:

ارتعاش با فرکانس بالا باعث می شود تعداد زیادی حباب کوچک (حباب های کاویتاسیون) در مایع تشکیل شوند. این حباب ها تحت تغییرات فشار به سرعت منبسط و فشرده می شوند و در نهایت به شدت می ترکند (فرو می ریزند).
هنگامی که حباب ها می ترکند، انرژی آنی عظیم (دمای بالا موضعی، فشار بالا و امواج شوک قوی) آزاد می شود و نیروی ضربه ای ایجاد شده مستقیماً ساختار غشای سلول (غشای سلولی، دیواره سلولی) را پاره می کند تا به قطعه قطعه شدن سلول دست یابد.
2. اثر کمکی: ارتعاش مکانیکی و نیروی برشی
ارتعاش مکانیکی با فرکانس بالای اولتراسوند نیز مستقیماً نیروی برشی و نیروی اصطکاک را روی سلول ها ایجاد می کند و به تخریب بیشتر ساختار سلولی، به ویژه برای سلول هایی با دیواره های سلولی ضخیم (مانند قارچ ها و سلول های گیاهی) کمک می کند.
3. فرآیند قطعه قطعه شدن (با در نظر گرفتن عملیات آزمایشی به عنوان مثال)
 سوسپانسیون سلولی که باید تحت درمان قرار گیرد (مانند مایع کشت باکتری، هموژنات بافتی و غیره) را در یک لوله سانتریفیوژ یا بشر قرار دهید، پروب اولتراسونیک (شیپور) را وارد کنید و پروب باید در مایع غوطه ور شود اما با دیواره ظرف تماس نداشته باشد.

دستگاه اولتراسونیک را روشن کنید و پارامترها (قدرت، زمان و غیره) را تنظیم کنید: ارتعاش با فرکانس بالا حباب های کاویتاسیون را در مایع ایجاد می کند و نیروی ضربه ای ایجاد شده توسط ترکیدن حباب ها مستقیماً ساختار سلولی را از بین می برد و مواد درون سلولی (از جمله اسیدهای نوکلئیک، پروتئین ها، متابولیت ها و غیره) را آزاد می کند.
2. کاربرد خاص اولتراسوند در استخراج DNA/RNA
مراحل اصلی استخراج DNA/RNA عبارتند از: تخریب سلولی برای آزاد کردن اسیدهای نوکلئیک → حذف ناخالصی ها (پروتئین ها، لیپیدها، پلی ساکاریدها و غیره) → خالص سازی اسیدهای نوکلئیک. نقش اولتراسوند عمدتاً در مرحله اول متمرکز است - تخریب سلولی کارآمد و آزادسازی اسید نوکلئیک. سناریوها و مزایای کاربردی خاص به شرح زیر است:
1. انواع نمونه مناسب
اولتراسوند برای استخراج اسید نوکلئیک از انواع نمونه ها مناسب است، از جمله:

بافت حیوانی (مانند کبد، عضله): ابتدا باید به قطعات کوچک بریده شود، اولتراسوند می تواند به سرعت سلول ها را مختل کرده و اسیدهای نوکلئیک را آزاد کند؛
باکتری ها/قارچ ها: دیواره های سلولی نسبتاً سخت هستند، روش های سنتی (مانند درمان با لیزوزیم) ناکارآمد هستند و اولتراسوند می تواند دیواره های سلولی را از طریق اثر کاویتاسیون قوی از بین ببرد؛
سلول های کشت شده (سلول های چسبنده یا معلق): تعلیق مستقیم و سپس اولتراسوند، هیچ پیش تصفیه پیچیده ای لازم نیست؛
بافت گیاهی: حاوی سلولز و پکتین است، اولتراسوند می تواند به شکستن دیواره های سلولی و آزاد کردن محتویات سلولی کمک کند.
2. پارامترهای کلیدی در عملیات (تأثیر بر کیفیت اسید نوکلئیک)
درمان اولتراسونیک نیاز به کنترل دقیق پارامترها دارد تا از تخریب اسید نوکلئیک یا قطعه قطعه شدن بیش از حد (تأثیر بر آزمایشات بعدی، مانند PCR، توالی یابی و غیره) جلوگیری شود:

قدرت: معمولاً 50-300 وات (با توجه به نوع نمونه تنظیم می شود، به عنوان مثال باکتری ها به قدرت بالاتری نیاز دارند). قدرت بیش از حد بالا باعث می شود که برش اسید نوکلئیک خیلی کوتاه شود و قدرت خیلی کم منجر به قطعه قطعه شدن ناکافی می شود.
زمان کار/فاصله: از درمان "پالس" استفاده کنید (مانند کار 30 ثانیه + استراحت 30 ثانیه) تا از تولید گرمای اولتراسونیک مداوم که منجر به دناتوره شدن اسید نوکلئیک می شود (DNA/RNA به راحتی در دمای بالا تخریب می شود) جلوگیری شود.
کل زمان درمان: به نمونه بستگی دارد (به عنوان مثال 1-3 دقیقه برای سلول های حیوانی و 3-5 دقیقه برای باکتری ها). درمان بیش از حد، قطعه قطعه شدن اسید نوکلئیک را تشدید می کند.
کنترل دما: حمام یخ در طول فرآیند (نمونه ها روی یخ قرار می گیرند)، زیرا فرآیند اولتراسونیک گرما تولید می کند (اثر کاویتاسیون همراه با دمای موضعی بالا)، دمای پایین می تواند فعالیت نوکلئاز را مهار کرده و از پایداری اسید نوکلئیک محافظت کند.

3. مزایا و اقدامات احتیاطی
مزایا
راندمان بالا: سریعتر از روش های سنتی (مانند آسیاب کردن، انجماد و ذوب مکرر، هیدرولیز آنزیمی) (معمولاً در عرض چند دقیقه تکمیل می شود) و تخریب کامل تر؛
جهانی بودن: قابل استفاده برای انواع نمونه ها (حیوانات، گیاهان، میکروارگانیسم ها و غیره)؛
آسان برای کار: هیچ معرف پیچیده ای لازم نیست، فقط ابزارهای اولتراسونیک و تجهیزات سانتریفیوژ اساسی مورد نیاز است.
اقدامات احتیاطی
اجتناب از حباب ها: اگر تعداد زیادی حباب در نمونه وجود داشته باشد، راندمان اثر کاویتاسیون کاهش می یابد و پروب ممکن است بیش از حد گرم شود. اطمینان حاصل کنید که پروب کاملاً در مایع غوطه ور شده است (سطح مایع حدود 1-2 سانتی متر است)؛
مهار نوکلئاز: پس از تخریب، محلول لیز (شامل EDTA، مواد شوینده و غیره) باید به موقع اضافه شود تا نوکلئازهای درون سلولی (مانند RNase که به راحتی RNA را تخریب می کند) مهار شود؛
حجم نمونه: حجم پردازش واحد نباید خیلی زیاد باشد (معمولاً ≤5mL)، در غیر این صورت توزیع انرژی اولتراسونیک ناهموار خواهد بود و اثر تخریب بسیار متفاوت خواهد بود.

خلاصه
اولتراسوند به طور موثر سلول ها را از طریق اثر کاویتاسیون و ارتعاش مکانیکی مختل می کند و یک "مرحله آزادسازی" کلیدی برای استخراج DNA/RNA فراهم می کند. هسته اصلی بهینه سازی قدرت، زمان و دما برای تخریب کامل سلول ها در حالی است که حداکثر محافظت از یکپارچگی اسید نوکلئیک را به حداکثر می رساند. این فناوری به طور گسترده در مرحله پیش پردازش آزمایشات زیست شناسی مولکولی (مانند کلونینگ ژن، qPCR، تجزیه و تحلیل رونویسی و غیره) استفاده می شود و یک ابزار مهم برای استخراج اسید نوکلئیک است.